检测 IgA 肾病中半乳糖缺乏型 IgA1 的新型凝集素非依赖性方法_Gd-IgA_诊断_疾病

检测 IgA 肾病中半乳糖缺乏型 IgA1 的新型凝集素非依赖性方法

Junichi Yasutake、 铃木 雄介, Hitoshi Suzuki, Hiura 直子, Hiroyuki Yanagawa, 牧田优子, Etsuji Kaneko, Yasuhiko Tomino 作者注释

肾脏病学透析移植，第 30 卷，第 8 期，2015 年 8 月，第 1315-1321 页，https://doi.org/10.1093/ndt/gfv221

背景

半乳糖缺陷型 IgA1 （Gd-IgA1） 是 IgA 肾病 （IgAN） 发病机制中的关键效应分子。尽管许多研究人员已经使用基于蜗牛螺旋 aspersa 凝集素 （HAA） 凝集素 （HAA） 的测定法测量了血清 Gd-IgA1 水平，但凝集素依赖性测定在稳定性方面存在一些严重的问题。在这项研究中，我们旨在建立一种更稳健、更稳定的酶联免疫吸附测定 （ELISA） 方法，该方法使用特异性单克隆抗体识别人 Gd-IgA1 中的铰链区 （Gd-IgA1 ELISA）。

方法

展开剩余95%

用人 Gd-IgA1 铰链区肽免疫大鼠，获得 Gd-IgA1 特异性单克隆抗体 KM55。因此构建了特异性检测血清 Gd-IgA1 的 Gd-IgA1 ELISA。使用 KM55 ELISA 测定法测量人类受试者的血清 Gd-IgA1 浓度。为了进一步确认 Gd-IgA1 特异性抗体的特异性，KM55 还用于肾活检标本石蜡包埋切片中肾小球 Gd-IgA1 的免疫荧光染色。

结果

通过 Gd-IgA1 ELISA 测量人类受试者血清 Gd-IgA1 水平显示，与其他肾脏疾病或非肾脏疾病患者相比，IgAN 患者的血清 Gd-IgA1 水平升高。重要的是，从 Gd-IgA1 ELISA 获得的结果与来自 HAA 凝集素的测定的结果呈正相关 （R = 0.75）。用 KM55 对肾活检标本进行免疫荧光染色，检测到 Gd-IgA1 和 IgA 的肾小球共定位。

结论

这种使用 KM55 测量血清 Gd-IgA1 水平的新型非凝集素非依赖性方法可以为更令人信服的 IgAN 诊断和活性评估铺平道路，并且可以加快临床研究以更好地了解这种困难的疾病。

ELISA、半乳糖缺陷型 IgA1、螺旋 aspersa 凝集素 （HAA）、IgA 肾病、免疫荧光、单克隆抗体

主题： 肾脏疾病酶联免疫吸附测定单克隆抗体荧光抗体技术Iga 肾小球肾炎肾小球凝集素免疫球蛋白 a诊断半乳糖肾大鼠肾活检

问题部分： 慢性肾脏病>临床科学

介绍

IgA 肾病 （IgA nephropathy， IgAN） 是全球诊断最常见的原发性肾小球肾炎之一，尤其是在包括日本在内的亚洲国家 [1]。大多数 IgAN 病例是通过尿液分析偶然发现的，并通过肾活检诊断 [1， 2]。然而，由于肾活检有其伴随的程序风险和保险范围的限制，因此需要为临床目的开发采用疾病特异性病原体或生物标志物的非侵入性诊断方法。在疾病发作前或疾病进展的早期阶段对 IgAN 进行无创诊断是特异性治疗的理想选择。半乳糖缺陷型 IgA1 （Gd-IgA1） 已被确定为 IgAN 发病机制中最令人信服的关键介质之一，尽管潜在的分子机制仍在研究中 [3–7]。

基于 HAA 凝集素的测定可以检测人血清样品中的 Gd-IgA1，在这项研究中发挥了不可或缺的作用，由于其对 N-乙酰半乳糖胺 （GalNAc） 残基的特异性识别，导致了几项重要发现 [3， 7， 8]。一般来说，凝集素能够与各种类型的糖蛋白聚糖结合，它们广泛分布在分枝杆菌、植物和动物中。关于O-连接聚糖，已知从蜗牛螺旋 aspersa 凝集素 （HAA）、蜗牛螺旋 pomatia 凝集素或植物 vicia villosa 中纯化的凝集素对 GalNAc 具有特异性亲和力 [9， 10]。使用基于 HAA 凝集素的测定法测定血清 Gd-IgA1 的几项研究表明，IgAN 患者的循环 Gd-IgA1 水平显著高于非肾脏疾病对照 [4， 6， 9]。此外，IgAN 中的血清 Gd-IgA1 水平与进展为终末期肾病的风险相关 [6]。HAA 凝集素还可用于培养细胞上清液中的 Gd-IgA1 检测，例如来自人类受试者的原代和永生化 B 细胞 [4， 11， 12]。因此，多年来，基于 HAA 凝集素的测定一直是临床和基础研究的有用工具，有望在未来有关 IgAN 病理学、诊断和治疗的研究中得到更更广泛的应用[13–15]。然而，基于 HAA 凝集素的测定有几个局限性。其中之一是它的生物活性和稳定性取决于 HAA 凝集素的产物批次。因此，强烈需要一种更稳健的检测循环 Gd-IgA1 的检测方法。

该研究的目的如下：（i） 获得并表征一种针对 Gd-IgA1 的新型独特单克隆抗体;（ii） 将其应用于强大的酶联免疫吸附测定 （ELISA） 系统，以检测血清 Gd-IgA1。

材料和方法

动物

Sprague-Dawley 大鼠 （4 周龄，雌性） 购自日本 SLC，Inc.（日本静冈），并根据 Kyowa Hakko Kirin Co.， Ltd. 的机构指南维持在特定的无病原体条件下。

Gd-IgA1 的产生

Gd-IgA1 由人血浆 IgA1 酶促产生。将市售人血浆 IgA1（BioPur AG，瑞士）与来自牛睾丸的 β-半乳糖苷酶（ProZyme，CA）和神经氨酸酶（Nacalai tesque，日本京都）在 37°C 下在乙酸钠缓冲液 （pH5.0） 中孵育 3 小时。

获得抗 Gd-IgA1 单克隆抗体

Gd-IgA1 特异性抗体，命名为 KM55，如下所述获得。作为抗原，人 IgA1 铰链区肽（氨基酸序列：H-C223PST*PPT*PS*PS*TPPT*PSPS240-NH2） 合成了在特定丝氨酸/苏氨酸残基（星号）上添加 5 个 GalNAc 残基（Sigma-Aldrich Japan，日本东京）。在施用 4 次 KLH 偶联抗原肽免疫 SD 大鼠后，从脾细胞中建立候选杂交瘤。通过将 ELISA 与抗原肽和酶促生成的 Gd-IgA1 结合来选择产生 Gd-IgA1 特异性单克隆抗体的杂交瘤。

Gd-IgA1 ELISA

使用 KM55 构建 Gd-IgA1 的夹心 ELISA。将 KM55 以 7.5 μg/mL 固定在 96 孔 ELISA 板 （NUNC MaxiSorp;Thermo Fisher Scientific，MA）在室温下放置 18 小时。随后在室温下用含有 1% 牛血清白蛋白 （BSA） 的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 封闭 2 小时。用乙酸钠缓冲液 （pH5.0） 以 1：50 的比例稀释血清样品，并在 37°C 下用神经氨酸酶处理 3 小时进行去唾液酸化。 用含有 0.05% Tween-20 （PBST） 的 PBS 洗涤 5 次后，将用胎牛血清（1：5 稀释）稀释的去唾液酸化血清样品在 KM55 包被的平板上在室温下孵育 2 小时。洗涤板，并在室温下与 HRP 偶联的小鼠抗人 IgA1 α1 链特异性单克隆抗体 （SouthernBiotech， AL） 以 1：1000 稀释液孵育 2 小时。洗涤后，最终用 SIGMAFAST O-苯二胺 （OPD） 溶液（Sigma-Aldrich Japan）着色，并用 1 mol/L 硫酸（Wako，Osaka，Japan）终止。通过参考光密度 （OD） （492 nm） 的标准曲线 （4 参数 logistic 曲线拟合） 推断每种血清 Gd-IgA1 的水平，并表示为单位。从人血浆 IgA1 中酶促生成的 Gd-IgA1 连续稀释 （1.37–1000 ng/mL） 并用作标准品。在本研究中，1 个单位定义为 1 μg/mL 酶促产生的 Gd-IgA1。

在本研究中，通过神经氨酸酶处理对血清样品进行去唾液酸化，类似于基于 HAA 凝集素的测定中的血清样品制备。由于以下原因，已经进行了神经氨酸酶治疗：（i） GalNAc 上唾液酸的存在可能会影响 HAA 凝集素对血清 Gd-IgA1 的识别，以及 （ii） IgA1 铰链区唾液酸的模式和数量可能因人而异。与基于 HAA 凝集素的测定不同，在添加到 KM55 预包被板之前对血清样品进行神经氨酸酶处理，以避免 KM55 因酸性条件而脱落。

基于 HAA 凝集素的测定

根据以前的报道，进行了基于 HAA 凝集素的测定 [4]。简而言之，将 100 ng IgA 的血清样品在平板上孵育，其中固定抗 IgA α1 链特异性多克隆抗体（2.5 μg/mL）并用含有 1% BSA 和 0.05% Tween-20 的 PBS 封闭。在 37°C 下用神经氨酸酶 （10 mU/mL，Roche diagnostics，瑞士巴塞尔） 进行孔内去唾液酸化处理 3 小时。 用 PBST 洗涤后，将板与生物素化的 HAA 凝集素（1：500 稀释;Sigma-Aldrich Japan） 在 37°C 下放置 2 小时。 通过超亲和素过氧化物酶（1：2000 稀释;Sigma-Aldrich Japan）和含过氧化氢的 OPD 溶液 （Sigma-Aldrich Japan）。结果以单位表示，通过将 OD 值 （492 nm） 乘以血清 IgA 浓度 （μg/mL） 计算得出。

血清 Gd-IgA1 的测定

IgAN 是通过尿液分析结果阳性的供体肾活检标本肾小球肾小球中结膜增生的 IgA 沉积诊断的。152 份 IgAN 血清样本，20 份其他肾脏疾病对照样本（补充数据，表 S1） 和 71 例尿液分析无阳性结果的非肾脏疾病对照样本通过 Gd-IgA1 ELISA 和基于 HAA 凝集素的测定分别测量 Gd-IgA1 水平。在每位捐献者的知情同意下，在顺天堂大学医院采集血样。所有方案均由顺天堂大学医院和协和麒麟有限公司的研究伦理审查委员会审查和批准。

竞争检测

使用基于 HAA 凝集素的测定方法进行检测 KM55 和 HAA 凝集素与酶促产生的 Gd-IgA1 之间的竞争性结合活性的测定。将 HAA 凝集素预混合，并在室温下与连续浓度的 KM55 孵育 30 分钟。将混合物添加到平板中以代替单个 HAA 凝集素。抑制作用计算为无 KM55 样品的 OD 值的相对百分比。

免疫荧光染色

经患者知情同意并经顺天堂大学医院研究伦理审查委员会和 Kyowa Hakko Kirin Co.， Ltd. 批准，在顺天堂大学医院获得肾活检标本，制备 3 μm 厚的石蜡包埋切片进行染色。通过一系列二甲苯/乙醇脱蜡并再水化后，在室温下用枯草杆菌蛋白酶 A （Sigma-Aldrich Japan） 进行抗原修复 2 小时。然后，用蒸馏水冲洗样品，并在室温下用 Protein Block（Dako Japan，Tokyo，Japan）封闭 30 分钟，然后与 KM55 （100 μg/mL） 在 37°C 下孵育 60 分钟。用含 0.05% 吐温-20 （TBST） 的 PBS 和 TBS 多次洗涤后，Alexa Fluor 555 偶联的山羊抗大鼠 IgG 抗体（1：1000 稀释;Life Technologies， CA） 在 37°C 下反应 30 分钟。用 PBS/TBST 洗涤样品，并与 FITC 偶联的兔多克隆抗人 IgA 抗体 （100 μg/mL;Dako Japan） 在 37°C 下放置 30 分钟。用 PBS/TBST 洗涤后，将载玻片密封在 Fluoromount （Diagnostic BioSystems， CA） 中。使用 BIOREVO 荧光显微镜 BZ-9000 （KEYENCE， Osaka， Japan） 观察荧光。

统计分析

使用 SAS 9.2 版 （SAS Institute， Inc.， Cary， NC） 进行统计分析。通过方差分析评估多个疾病组之间的差异，然后进行 Bonferroni 校正以进行多重比较。通过简单的线性回归分析评估两种不同方法的测量之间的关系。数据表示为 SD ±平均值。<0.05 的 P 值被认为具有统计学意义。

结果

GalNAc 特异性单克隆抗体 KM55 可识别 Gd-IgA1

为了获得 Gd-IgA1 特异性单克隆抗体，采用了使用人 IgA1 铰链区肽作为抗原的杂交瘤方法。由于已表明 IgAN 患者 IgA1 铰链区的至少 5 个位点（230Ser、232Ser、225Thr、228Thr 和 236Thr）可能存在半乳糖缺陷型 O-糖 [15–17]，因此我们通过向这 5 个氨基酸位点添加 GalNAc 合成了人 IgA1 铰链区肽。用这种肽对大鼠进行免疫产生了几个杂交瘤克隆。

在随后使用酶促生成的人 Gd-IgA1 和抗原肽的结合测定中，选择了 KM55，一种单克隆大鼠 IgG2b 抗体。在平板上，我们将酶促产生的 Gd-IgA1 与 β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶或血浆衍生的聚糖完整人 IgA1 固定在一起;然后我们添加了 KM55。我们观察到 KM55 以剂量依赖性方式与 Gd-IgA1 结合，而即使在高剂量下它也不会与聚糖完整的人 IgA1 结合（图 1A），表明 KM55 识别 Gd-IgA1 但不识别聚糖完整的 IgA1。当添加 HAA 凝集素而不是 KM55 时，在剂量依赖性和特异性方面观察到相当的结合特性（图 1B）。在这些结合测定中，使用抗 IgA1 抗体确认固定化 Gd-IgA1 和游离寡糖完整 IgA1 的量（数据未显示）。此外，在 BIAcore 分析中评估 KM55 的 Ka 值为 1.68 × 104（米−1s−1），KD 值为 1.24 × 10−3（s−1） 和 KD 值为 7.4 × 10−8（m） 与 Gd-IgA1 的匹配。由于 KM55 特异性识别 Gd-IgA1 而不是聚糖完整的 IgA1，因此建议 KM55 可用于致病性 Gd-IgA1 的凝集素非依赖性 ELISA。

图 1：KM55 与 Gd-IgA1 的特异性结合。横轴代表 KM55 或 HAA 凝集素的浓度，纵轴代表 OD。（A） KM55 特异性识别人血浆 IgA1 （闭合圈） 中酶促生成的 Gd-IgA1，但不识别聚糖完整的人血浆 IgA1 （开放圈）;（B） HAA 凝集素表现出对酶促产生的 Gd-IgA1 （闭合圆圈） 的特异性;然而，它不能识别聚糖完整的 IgA1（闭合圈）和 KM55。

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凝集素非依赖性 Gd-IgA1 ELISA 显示 IgAN 患者血清 Gd-IgA1 水平升高

KM55 使我们能够成功建立夹心 ELISA 测定 （Gd-IgA1 ELISA），其中血清 Gd-IgA1 被固定的 KM55 捕获，因此被辣根过氧化物酶 （HRP） 偶联的抗人 IgA 多克隆抗体检测。通过 Gd-IgA1 ELISA 测定酶促生成的人 Gd-IgA1 的典型标准曲线如下所示补充数据，图 S1.

使用聚糖完整的人 IgA1 检测 Gd-IgA1 ELISA 对 Gd-IgA1 的特异性（图 2）。Gd-IgA1 ELISA 以剂量依赖性方式识别酶促产生的 Gd-IgA1。即使在高浓度下，人血浆中游离寡糖完整 IgA1 的吸光度也保持恒定。通过对 3 个独立的人血清样品进行 5 次单独测量来评估批间变异系数 （CV）。通过在单板上对 3 个独立的人血清样品进行 20 次测量来评估批内 CV。批间和批内 CV 分别为 3.2-7.4% 和 2.8-5.1%（表 1A 和 B）。

表 1.

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Gd-IgA1 ELISA 的特点

A. 批间测量值（单位）SD 值（单位）CV 值 （%）n3.51.07.456.60.83.2515.62.84.65B. 批内3.50.42.8206.61.45.12015.62.03.120

批间 （A） 和批内 （B） 变异系数 （CV） 显示为测量的重现性。

图 2：建立 Gd-IgA1 ELISA 作为检测 Gd-IgA1 的可靠和特异性方法。横轴表示 Gd-IgA1 或完整 IgA1 的浓度，纵轴表示 OD。酶促产生的 Gd-IgA1（闭合环）被特异性识别，而来自 Gd-IgA1 ELISA 的聚糖完整 IgA1（空环）在 Gd-IgA1 ELISA 中未被识别 （R = 0.99）。

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使用 GalNAc 特异性单克隆抗体 KM55，我们检查了 IgAN、其他肾脏疾病 （补充数据，表 S1）和非肾脏疾病。从酶促生成的 Gd-IgA1 的标准曲线推断血清样品的 OD 值后，血清 Gd-IgA1 水平的最终值以单位表示。在本研究中，1 个单位定义为 1 μg/mL 的标准 Gd-IgA1。在我们的队列中，IgAN 患者的血清 Gd-IgA1 水平在 1.5 至 25.4 单位之间，而在其他肾脏疾病中为 1.8 至 16.2 单位，在非肾脏疾病中为 0.5 至 9.6 单位（图 3A）。在 IgAN 患者 （N = 152） 中，27.6% 的血清 Gd-IgA1 水平高于 9.6 单位，这是在其他肾脏疾病队列中测得的最大值;其余 72.4% 的血清 Gd-IgA1 水平在预期的正常范围内 （<9.6 U）。统计分析显示，与其他肾脏疾病患者 （4.1 ± 3.2 单位，N = 20，P < 0.001 vs IgAN） 和非肾脏疾病患者 （3.2 ± 2.1 单位，N = 70，P < 0.001 vs IgAN） 相比，IgAN 患者 （N = 152） 的平均 Gd-IgA1 水平 （8.0 ± 4.4 单位） 显著升高。

图 3： 通过 Gd-IgA1 ELISA 和基于 HAA 凝集素的测定法测量血清 Gd-IgA1 水平。（A） 通过 Gd-IgA1 ELISA 测定 IgAN 、其他肾脏疾病和非肾脏疾病患者血清 Gd-IgA1 水平;（B） 通过基于 HAA 凝集素的测定法测量相同样品的血清 Gd-IgA1 水平;（C） 分析 Gd-IgA1 ELISA 与基于 HAA 凝集素的测定之间的关系。绘制 IgAN （圆圈） 、其他肾脏疾病 （三角形） 和非肾脏疾病 （菱形） 患者的结果。通过这两种独立方法获得的值表现出正相关 （R = 0.75）。<0.05 的 P 值被认为具有统计学意义。

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为了确认 Gd-IgA1 ELISA 是否具有与传统基于 HAA 凝集素的方法相似的反应性与血清 Gd-IgA1 的反应性，使用相同的样品检查 Gd-IgA1 ELISA 和基于 HAA 凝集素的测定之间的相关性。与之前的报道一致 [4， 6]，在我们的队列中，通过基于 HAA 凝集素的测定法检测到的血清 Gd-IgA1 水平也显著高于其他肾脏疾病 （168.4 ±± 62.0 单位，N = 20，P < 0.001 vs IgAN） 和非肾脏疾病 （187.3 ± 65.6 单位，N = 70，P < 0.001 vs IgAN）（图 3B）。图 3C 显示了由这两种方法分别测定的血清 Gd-IgA1 水平之间的正相关 （R = 0.75，P < 0.001）。

接下来，我们在基于 HAA 凝集素的测定中检查了 KM55 对 HAA 凝集素的竞争活性。我们发现 KM55 与 HAA 凝集素以剂量依赖性方式与 Gd-IgA1 结合（图 4），表明 Gd-IgA1 中 KM55 和 HAA 凝集素的目标区域重叠。这些结果强烈表明 KM55 也能够检测血清 Gd-IgA1 分子，类似于 HAA 凝集素。

图 4：KM55 和 HAA 凝集素与 Gd-IgA1 结合的竞争分析。KM55 以剂量依赖性方式部分抑制 HAA 凝集素与酶促产生的 Gd-IgA1 的结合。

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最后，为了进一步确认 KM55 是否识别 IgAN 患者的致病性 Gd-IgA1，对 IgAN 的肾活检标本进行了免疫组织化学分析。KM55 免疫荧光显示肾皮层 Gd-IgA1 的弥漫性和整体肾小球染色，这种模式类似于 IgA 的模式。此外，Gd-IgA1 和 IgA 的双重染色显示 Gd-IgA1 主要位于系膜区域;然而，IgA 的定位与 Gd-IgA1 的定位相似，但观察到的更广泛（图 5A-C）。KM55 免疫荧光在微小变化肾病综合征中未显示非特异性肾小球染色 （数据未显示）。

图 5：IgAN 患者肾活检标本中肾小球 Gd-IgA1 和 IgA 沉积的免疫荧光染色。（A） KM55 识别主要位于系膜区域的致病性 Gd-IgA1;（B） IgA 沉积得到更广泛的观察;（C） 合并图像显示 Gd-IgA1 和 IgA 共定位。

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讨论

本研究表明，使用抗 Gd-IgA1 单克隆抗体 KM55 的新型非凝集素非依赖性 ELISA 测定是检测血清 Gd-IgA1 的可靠方法，表明 Gd-IgA1 ELISA 可以克服传统基于 HAA 凝集素的方法的几个局限性。

HAA 凝集素可以从天然来源（即蜗牛 HAA）中分离出来，并由制造商通过亲和层析作为高度纯化的蛋白质提供。HAA 凝集素具有识别 Gd-IgA1 上 GalNAc 的独特特性。然而，这种取决于凝集素来源的生物活性多年来一直困扰着该领域的研究人员，因为难以获得适合血清 Gd-IgA1 检测的 HAA 凝集素。

另一方面，Gd-IgA1 ELISA 利用了可以从杂交瘤细胞中稳定获得的抗 Gd-IgA1 单克隆抗体。根据我们的竞争试验，KM55 部分抑制 HAA 凝集素与酶促产生的 Gd-IgA1 结合;我们假设 KM55 和 HAA 凝集素在循环 Gd-IgA1 分子的铰链区部分共享一个结合位点。因此，我们发现 Gd-IgA1 ELISA 和常规基于 HAA 凝集素的测定在血清 Gd-IgA1 水平测量方面呈正相关。因此，用于测定 IgAN 中 Gd-IgA1 的新型 Gd-IgA1 ELISA 对于临床实践中的医生和研究人员来说是一种可靠的检测方法 [13]。

由于 Gd-IgA1 ELISA 使用一系列酶促生成的 Gd-IgA1 作为标准，因此计算出的 Gd-IgA1 水平并不总是等同于生理性 Gd-IgA1 的水平。因此，我们采用了一种外推生理 Gd-IgA1 水平并以单位表达的系统。参考酶促生成的 Gd-IgA1 的标准曲线，血清 Gd-IgA1 水平在 1 至 30 μg/mL 之间。这使我们能够估计血清 Gd-IgA1 与总 IgA 的比率。

肾活检标本上 KM55 的免疫荧光染色清楚地表明 Gd-IgA1 的特异性肾小球定位，支持 KM55 识别 IgAN 患者的致病性 Gd-IgA1 [18， 19]。KM55 对 IgAN 患者肾小球 Gd-IgA1 的特异性通过同时添加大量重组 Gd-IgA1 但未添加重组聚糖完整 IgA1 后 KM55 染色减弱证实，类似于肾小球的黑影图像（数据未显示）。值得注意的是，在每位 IgAN 患者中都发现了 Gd-IgA1 的沉积，然而，正如预期的那样，尽管染色模式和幅度因患者而异。由于 Gd-IgA1 ELISA 显示 IgAN 患者血清 Gd-IgA1 水平升高，免疫荧光中的这些发现为循环 Gd-IgA1 是 IgAN 的有效诱导剂之一 [5] 和实时生物标志物的假设提供了额外的支持[13， 20]。

为了更好地了解 IgAN 中的致肾性 Gd-IgA1，仍有几个基本和临床问题有待解决。首先，需要通过关注个体患者的疾病史和接受的治疗来进一步评估血清 Gd-IgA1 水平与其在 IgAN 中的病理活性之间的关系。特别是，大多数血清 Gd-IgA1 水平在预期正常范围内的 IgAN 患者应进一步检查和评估。其次，血清 Gd-IgA1 水平是否反映了持续接受治疗的 IgAN 患者的临床疗效，例如缓解和复发 [2， 13]。阐明这种关系将有助于改善 IgAN 的治疗方式 [2， 13]。第三，通过 Gd-IgA1 ELISA 测量的血清 Gd-IgA1 水平有可能成为 IgAN 治疗诊断和适应症的关键实时生物标志物之一 [20]。然而，还应评估是否存在含有 Gd-IgA1 的免疫复合物 [5， 11， 21]。第四，下一个重要挑战是研究 KM55 阳性肾 Gd-IgA1 如何影响每个肾小球病变，例如系膜增生和细胞外基质扩增 [21， 22]。最后，还需要考虑分析 KM55 在 Gd-IgA1 铰链区上的特异性结合位点。

总之，我们建立了一种新的不依赖凝集素的 Gd-IgA1 ELISA，可以检测 IgAN 患者的血清 Gd-IgA1。这种稳定的分析可以帮助我们了解 IgAN 与聚糖畸变相关的发病机制。

利益冲突声明

没有人宣布。这项研究得到了 Kyowa Hakko Kirin Co.， Ltd. 的研究资助，该资助基于顺天堂大学和 Kyowa Hakko Kirin Co.， Ltd. 之间的合作研究。

（参见 Coppo 的相关文章。一种新的单克隆抗体，用于检测作为 IgA 肾病血清生物标志物的脱半乳糖基化 IgA1。肾醇 Dial 移植 2015;30: 1234–1236.)

确认

发布于：上海市